AAT Bioquest 12601/12603 Amplite® Fluorimetric Beta-Galactosidase Assay Kit *Green/*Red Fluorescence*

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美國AAT Bioquest Inc.(前身是ABD Bioquest，Inc.)是一家為從事生命科學(xué)研究、診斷研發(fā)及藥物開發(fā)的科學(xué)家研發(fā)、生產(chǎn)和銷售生物分析研究試劑和試劑盒的公司。公司致力于光譜學(xué)檢測領(lǐng)域，包括吸收（顏色），熒光和發(fā)光技術(shù)。AAT Bioquest的產(chǎn)品幫助quan世界的科學(xué)家和生物醫(yī)藥研究者更好的了解生物化學(xué)，免疫學(xué)，細胞生物學(xué)和分子生物學(xué)等領(lǐng)域。AAT Bioquest會不斷介紹新產(chǎn)品，快速的豐富各個領(lǐng)域的產(chǎn)品。

AAT Bioquest 12601  Amplite® Fluorimetric Beta-Galactosidase Assay Kit *Green Fluorescence*  500 Tests

AAT Bioquest 12603  Amplite® Fluorimetric Beta-Galactosidase Assay Kit *Red Fluorescence*  200 Tests

 AAT Bioquest 熒光β-半乳糖苷酶測定試劑盒

AAT Bioquest 12601  Amplite® Fluorimetric Beta-Galactosidase Assay Kit *Green Fluorescence*  500 Tests，產(chǎn)品說明：

大腸桿菌β-半乳糖苷酶是一種464 kD四聚體。β-半乳糖苷酶的每個單位由五個結(jié)構(gòu)域組成，其中第三個是活性位點。它是細胞中必需的酶。這種酶的缺乏會導(dǎo)致半乳唾液分泌或Morquio B綜合征。在大腸桿菌中，β-半乳糖苷酶由LacZ操縱子的活化產(chǎn)生。LacZ表達的檢測已成為常規(guī)，每個細胞只需檢測5個拷貝的？-半乳糖苷酶。該試劑盒使用熒光半乳糖苷酶底物，可以靈敏地區(qū)分 LacZ+ 與 LacZ 細胞。它既可用于檢測 ELISA 型測定系統(tǒng)中的半乳糖苷酶偶聯(lián)物，也可用于監(jiān)測細胞中的 LacZ 基因表達。半乳糖苷酶裂解產(chǎn)物具有發(fā)射光譜，大多數(shù)配備FITC濾光片組的熒光儀器都可以檢測到該光譜。

組件

組分A：熒光素二-β-D-吡喃半乳糖苷（FDG） 1瓶

組分B：反應(yīng)緩沖液 1 瓶 （50 mL）

組件 C：停止緩沖區(qū) 1 瓶 （25 mL）

組分D：裂解緩沖液 1 瓶 （25 mL）

構(gòu)成部分E：DMSO 1 瓶 （500 μL）

組分F：β-巰基乙* 1 瓶 （500 μL）

示例協(xié)議

一目了然

協(xié)議摘要

1. 用LacZ基因制備穩(wěn)定或瞬時轉(zhuǎn)染的細胞

2. 用測試化合物孵育細胞（樣品）

3. 裂解細胞

4. 將裂解物轉(zhuǎn)移到微量滴定板上

5. Add FDG working solution

6. 根據(jù)細胞類型在室溫或 37°C 下孵育至少 5 分鐘

7. 添加停止解決方案

8. 監(jiān)測Ex/Em = 490/525 nm處的熒光強度

重要提示 使用前將所有試劑盒組件解凍至室溫。

儲備溶液的制備

除非另有說明，否則所有未使用的儲備溶液應(yīng)分成一次性等分試樣，并在制備后儲存在-20°C。避免反復(fù)凍融循環(huán)。

FDG stock solution (1X)

將 125 μL DMSO（組分 E）加入 FDG（組分 A）小瓶中，制成 1X FDG 儲備溶液。注意：25 μL FDG 足以用于 1 個板。避光保存。

標準溶液的制備

β-半乳糖苷酶標準品

可選（如果需要標準曲線）：用0.3%β-巰基乙*測定緩沖液制備β-半乳糖苷酶（大腸桿菌）標準品的連續(xù)稀釋液。將標準曲線上每個點的 50 μL 等分試樣轉(zhuǎn)移到板的對照孔中。β-半乳糖苷酶的最高推薦量為 200 mU/mL （200 - 400 ng）。建議對由2個點組成的標準曲線進行8X連續(xù)稀釋。注意：調(diào)整標準曲線以適應(yīng)特定的實驗條件，例如細胞類型、數(shù)量、轉(zhuǎn)染效率和培養(yǎng)板的大小。每次進行測定時，必須新鮮制備標準曲線的稀釋液。

工作溶液的制備

1. 0.3%β-巰基乙*測定緩沖液

將 30 μL β-巰基乙*（組分 F）加入 10 mL 反應(yīng)緩沖液（組分 B）中，混合均勻。注意：制備酶稀釋緩沖液需要額外的緩沖液，用于生成標準曲線。

2. FDG working solution

將 25 μL 1X FDG 儲備溶液加入 5 mL 0.3 % β-巰基乙*測定緩沖液中。注意：不要將FDG溶液長時間保存在室溫下，因為會發(fā)生自發(fā)水解。

3.裂解緩沖液工作液

使用前將 5 μL β-巰基乙*（組分 F）加入 5 mL 裂解緩沖液（組分 D）中。注意：在裂解細胞之前，始終將0.1%β-巰基乙*加入裂解緩沖液中

實驗方案樣本

表 1. 推薦的細胞培養(yǎng)板裂解緩沖液工作溶液體積。

制備哺乳動物細胞的細胞提取物

1. 用測試化合物處理含有LacZ基因的細胞一段時間。

2. 用1X PBS洗滌細胞兩次。不要移開細胞。

3. 用裂解緩沖液工作溶液相應(yīng)地裂解細胞。對于貼壁細胞：將裂解緩沖液工作溶液添加到培養(yǎng)板中。有關(guān)建議的卷，請參見表 1。對于非貼壁細胞：將細胞沉淀到離心管中，并向管中加入 50 - 2000 μL（取決于細胞沉淀的大?。┝呀饩彌_液工作溶液。

4. 將上一步的細胞在室溫下孵育10-15分鐘，并輕輕旋轉(zhuǎn)板或試管數(shù)次以確保wan全裂解。

5. 進行FDG測定或?qū)悠防鋬鲈?80°C直至使用。注意：良好的裂解也可以通過快速凍融循環(huán)獲得（在-1°C至-2°C下冷凍20-80小時，在室溫下解凍）。或者，將細胞裂解液離心2-3分鐘以沉淀不溶性物質(zhì)，然后測定上清液。

運行 β-半乳糖苷酶測定

1. 如果需要，在室溫下解凍裂解細胞的管或板。如果將細胞接種在96孔板中，則直接在96孔板上進行測定。

2. 將 50 μL 細胞提取物加入 96 孔板的每個孔中。如果需要標準曲線，請為標準曲線（50 μL/孔）保存一些對照孔。注意：如有必要，當(dāng)轉(zhuǎn)染效率非常高時，將裂解液稀釋在裂解緩沖液工作溶液中，或在轉(zhuǎn)染效率低時減少裂解緩沖液的體積。如果在96孔板中進行轉(zhuǎn)染，或者將穩(wěn)定的細胞系接種到96孔板中，則直接在板上進行測定。對于內(nèi)源性β-半乳糖苷酶活性控制，從未轉(zhuǎn)染的細胞中加入 50 μL 細胞裂解物。對于空白對照，加入 50 μL 1X 裂解緩沖液。

3. 向每個孔中加入 50 μL FDG 工作溶液。根據(jù)細胞類型，將板在室溫或 37°C 下孵育約 5 分鐘至 4 小時。

4. 向每個孔中加入 50 μL 終止緩沖液（組分 C）。終止緩沖液除了終止反應(yīng)外，還會導(dǎo)致產(chǎn)物的熒光強度增加。

5. 使用熒光酶標儀在Ex / Em = 490 / 525nm處測量每個孔中溶液的熒光強度。

6. 根據(jù)線性標準曲線定量β-半乳糖苷酶表達。

AAT Bioquest 12601  Amplite® Fluorimetric Beta-Galactosidase Assay Kit *Green Fluorescence*  500 Tests，產(chǎn)品說明：

大腸桿菌β-半乳糖苷酶是一種464 kD四聚體。β-半乳糖苷酶的每個單位由五個結(jié)構(gòu)域組成，其中第三個是活性位點。它是細胞中必需的酶。這種酶的缺乏可導(dǎo)致半乳唾液酸病或Morquio B綜合征。在大腸桿菌中，β-半乳糖苷酶由LacZ操縱子的活化產(chǎn)生。LacZ表達的檢測已成為常規(guī)，每個細胞只需檢測5個拷貝的β-半乳糖苷酶。該試劑盒使用紅色熒光半乳糖苷酶底物，可以靈敏地區(qū)分 LacZ+ 和 LacZ- 細胞。非熒光亞狀態(tài)在與半乳糖苷酶反應(yīng)時產(chǎn)生強熒光產(chǎn)物。它既可用于檢測 ELISA 型測定系統(tǒng)中的半乳糖苷酶偶聯(lián)物，也可用于監(jiān)測細胞中的 LacZ 基因表達。Amplite®熒光β-半乳糖苷酶檢測試劑盒隨附所有基本成分和優(yōu)化的檢測方案。它可與熒光酶標儀、熒光顯微鏡或流式細胞儀一起使用。它也可用于篩選半乳糖苷酶抑制劑或誘導(dǎo)劑。

組件

組分A：β-半乳糖苷 1瓶

組分B：反應(yīng)緩沖液 1 瓶 （20 mL）

組件 C：停止緩沖區(qū) 1 瓶 （10 mL）

組分D：裂解緩沖液 1 瓶 （10 mL）

構(gòu)成部分E：DMSO 1 瓶 （100 μL）

組分F：β-巰基乙*     1 瓶 （100 μL）

示例協(xié)議

一目了然

協(xié)議摘要

1. 用LacZ基因制備穩(wěn)定或瞬時轉(zhuǎn)染的細胞

2. 用測試化合物孵育細胞（樣品）

3. 裂解細胞

4. 將裂解物轉(zhuǎn)移到微量滴定板上

5. 添加β-Gal 工作溶液

6. 根據(jù)細胞類型在室溫或 37°C 下孵育至少 10 分鐘

7. 添加停止解決方案

8. 監(jiān)測Ex/Em = 540/590 nm處的熒光強度

重要注意事項

使用前將所有套件組件解凍至室溫。

儲備溶液的制備

除非另有說明，否則所有未使用的儲備溶液應(yīng)分成一次性等分試樣，并在制備后儲存在-20°C。避免反復(fù)凍融循環(huán)。

1. β-半乳糖苷酶底物儲備溶液（200X）：

將50 μL DMSO（組分E）加入試鹵靈β-半乳糖苷酶（組分A）小瓶中，制成200X β-半乳糖苷酶底物儲備溶液。注意：25 μL β-半乳糖苷酶底物儲備溶液足以用于 1 個板。避光保存。

標準溶液的制備

β-半乳糖苷酶標準品

可選（如果需要標準曲線）：用0.3%β-巰基乙*測定緩沖液制備β-半乳糖苷酶（大腸桿菌）標準品的連續(xù)稀釋液。將標準曲線上每個點的 50 μL 等分試樣轉(zhuǎn)移到板的對照孔中。β-半乳糖苷酶的最高推薦量為 200 mU/mL （200 - 400 ng）。建議對由 1 個點組成的標準曲線進行 3：8 連續(xù)稀釋。注意：調(diào)整標準曲線以適應(yīng)特定的實驗條件，例如細胞類型、數(shù)量、轉(zhuǎn)染效率和培養(yǎng)板的大小。每次進行測定時，必須新鮮制備標準曲線的稀釋液。

工作溶液的制備

1. 0.3 % β-巰基乙*測定緩沖液：

將 30 μL β-巰基乙*（組分 F）加入 10 mL 反應(yīng)緩沖液（組分 B）中，并充分混合。注意：制備酶稀釋緩沖液需要額外的緩沖液，用于生成標準曲線。

2. β-Gal工作溶液：

將25 μL β-半乳糖苷酶底物儲備溶液（200X）加入5 mL 0.3%β-巰基乙醇測定緩沖液中。注意：β-Gal工作溶液足以用于一個96孔板。

3. 裂解緩沖液工作溶液：

使用前將 5 μL β-巰基乙*（組分 F）加入 5 mL 裂解緩沖液（組分 D）中。注意：在裂解細胞之前，始終將0.1%β-巰基乙*加入裂解緩沖液中

實驗方案樣本

表 1.推薦的細胞培養(yǎng)板裂解緩沖液工作溶液體積。

培養(yǎng)板類型 裂解緩沖液工作溶液（μL/孔）

96孔板   50

24孔板   250

12孔板  500

6孔板   1000

60mm板 2000

100mm板 4000

制備哺乳動物細胞的細胞提取物

1. 用測試化合物處理含有LacZ基因的細胞一段時間。

2. 用1X PBS洗滌細胞兩次。不要移開細胞。

3. 用裂解緩沖液工作溶液相應(yīng)地裂解細胞。

對于貼壁細胞：將裂解緩沖液工作溶液添加到培養(yǎng)板中。有關(guān)建議的卷，請參見表 1。

對于非貼壁細胞：將細胞沉淀到離心管中，并向管中加入 50 - 2000 μL（取決于細胞沉淀的大?。┝呀饩彌_液工作溶液。

4. 將上一步的細胞在室溫下孵育10-15分鐘，并輕輕旋轉(zhuǎn)板或試管數(shù)次以確保wan全裂解。

5. 進行β-半乳糖苷酶測定或?qū)悠防鋬鲈?80°C直至使用。注意：良好的裂解也可以通過快速凍融循環(huán)獲得（在-1°C至-2°C下冷凍20-80小時，在室溫下解凍）。或者，將細胞裂解液離心2-3分鐘以沉淀不溶性物質(zhì)，然后測定上清液。

運行 β-半乳糖苷酶測定

1. 如果需要，在室溫下解凍裂解細胞的管或板。如果將細胞接種在96孔板中，則直接在96孔板上進行測定。

2. 將 50 μL 細胞提取物加入 96 孔板的每個孔中。如果需要標準曲線，請為標準曲線（50 uL/孔）保存一些對照孔。注意：如有必要，當(dāng)轉(zhuǎn)染效率非常高時，將裂解液稀釋在裂解緩沖液工作溶液中，或在轉(zhuǎn)染效率低時減少裂解緩沖液的體積。如果在96孔板中進行轉(zhuǎn)染，或者將穩(wěn)定的細胞系接種到96孔板中，則直接在板上進行測定。對于內(nèi)源性β-半乳糖苷酶活性控制，從未轉(zhuǎn)染的細胞中加入 50 μL 細胞裂解物。對于空白對照，加入 50 μL 裂解緩沖液工作溶液。

3. 向每個孔中加入50 μL β-Gal 工作溶液。根據(jù)細胞類型，將板在室溫或37°C下孵育約10分鐘至4小時。

4. 向每個孔中加入50μL終止緩沖液（組分 C）。終止緩沖液除了終止反應(yīng)外，還會導(dǎo)致產(chǎn)物的熒光強度增加。

5. 使用熒光酶標儀在Ex / Em = 540 / 590nm（截止= 570nm）處測量每個孔中溶液的熒光強度。

  AAT Bioquest 熒光β-半乳糖苷酶測定試劑盒

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